Презентация, доклад на тему Серологические реакции и вирусные исследования

вирусологическое исследование

антигеном и соответствующим ему специфическим антителом in vitro, имеющие различные внешние проявления.
Широко используются в микробиологических и серологических лабораториях с целью:
серодиагностики бактериальных, вирусных, реже других инфекционных заболеваний,
сероидентификации выделенных бактериальных, вирусных и других культур различных микроорганизмов

диагностикума
обнаружение неизвестных антигенов с помощью известных антител.
Для серологической идентификации возбудителя – определение серогруппы, серовара возбудителя с помощью специфической иммунной диагностической сыворотки

за счет водородных, кулоновских и вандерваальсовых сил.

Неспецифическая (видимая, медленная, необратимая) – появление видимых изменений: агглютинации, гемолиза и т.д.

с помощью данной реакции.

Специфичность - способность антигенов или антител реагировать только с гомологичными антителами, содержащимися в сыворотке крови, либо с гомологичными антигенами соответственно.

преципитации

Наиболее полно механизм соединения антигена и антитела объяснен гипотезой Маррека (теория "решетки") и Полинга (теория "фермы") .

Маррек рассматривает соединение антигена и антител в виде решетки, в которой антиген чередуется с антителом, образуя решетчатые конгломераты.

Согласно гипотизе Полинга антитела имеют две валентности (две специфические детерминанты), а антиген несколько валентностей - он поливалентен. При соединении антигена и антител образуются агломераты, напоминающие "фермы" построек.

прочные комплексы, видимые простым глазом.

При избытке антигена каждый активный центр антител заполнен молекулой антигена, не хватает антител для соединения с другими молекулами антигена и образуются мелкие, невидимые глазом комплексы.

При избытке антител, для образования решетки не хватает антигена, детерминанты антител отсутствуют и видимого проявления реакции нет.

путем их склеивания антителами с образованием аггломератов – хлопьев, в присутствии электролита NaCl.

РА используют для:
Серотипирования выделенной чистой культуры возбудителя
Экспресс-обнаружения возбудителя
обнаружения антител в сыворотке крови больного животного

эритроцит)
Антитело – IgM (валентность 5)
Физраствор

Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие O- антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации.
Агглютинация с Н - диагностикумом (бактерии, убитые формалином,сохранившие жгутиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.


Способы постановки: РА на стекле; развернутая
РА

возбудителя, реже для ускоренного обнаружения антител

Постановка реакции:
На предметное стекло помещают каплю сыворотки (Опыт) и каплю физраствора (Контроль)
В каждой капле распределяют взвесь бактерий
Появление мелкозернистой или хлопьевидной агглютинации – положительный результат
Равномерное помутнение – отрицательный результат

Опыт «+» Контроль «-»

реакции:
Развернутую РА проводят в пробирках или лунках пластин.
При этом готовят десятикратные разведения исследуемой сыворотки и вносят одинаковые количества антигена.
При положительном результате на дне пробирки образуется рыхлый осадок и сам раствор становится прозрачным,
отрицательный результат- помутнение раствора сохраняется

«+» «-»

который основан на способности корпускулярных носителей( эритроцитов, шариков латекса, клеток стафилококков) адсорбировать на своей поверхности растворимые антигены.
- В зависимости от типа
корпускулярного носителя различают:
РНГА
Латекс-агглютинация
РКоА

адсорбированными на
них антигенами)
2. Исследуемая сыворотка
3. Физраствор

 РНГА ставят в пластиковых планшетках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.

Титр сыворотки= 1:160 (максимальное разведение исследуемого материала, при котором реакция положительна)

с адсорбированными на
них антителами
2. Исследуемый материал
3. Физраствор

 Постановка РОНГА не отличается от РНГА
Применение: обнаружение аг (например, бактериального экзотоксина)

них молекулами антигенов или антител агглютинируются соответствующими антигенами или антителами. Применяют качественный и количественный методы. Ставят по типу агглютинации на стекле.

антитело

Латексные частицы, покрытые антигенами

это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом.
Компоненты реакции:
Антиген – мелкодисперсный, растворимый
Антитело – IgG (валентность 2)
Физраствор

Преципитат образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах, избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.

Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.

Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиапьная иммунодиффузия, иммуноэпектрофорез и др.

наслаивают растворимый антиген.

При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата.

Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется реакцией-термопреципитации (реакция, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен).

Опыт Контроль

тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после затвердевания в нем вырезают лунки.
В лунки геля раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу.
В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы.

Двойная радиальная иммунодиффузия представляет собой прежде всего метод количественного анализа. Ее применяют для определения количества антигена в жидкостях (сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, экстракты тканей). Ее также применяют для проверки чистоты препаратов, при получении антисывороток животных и оценке эффективности иммунизации. 

У многокомпонентных систем между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных АГ линии преципитата сливаются; у неидентичных АГ - пересекаются.

на стекло.
После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях.
Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок.
Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена.

Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.

Зависимость диаметра кольца преципитации от количества аг

Принцип ИЭФ состоит в следующем:
Вначале проводят электрофоретическое разделение белков в забуференном геле агара;
после разделения в канавку, которая идет в направлении миграции белков, вносят преципитирующую иммунную сыворотку.
АГ и АС диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия возникают дугообразные линии преципитации, число, положение и форма которых дают представление о составе исходной смеси антигенов.

антител – антитоксинов подавлять биологическую активность экзотоксинов бактерий при образовании комплекса аг-ат.

А

Исслед.материал+ ат против токсина В

Исслед.материал+ ат против токсина Е

минимальное количество токсина:
При наличии антител против дифтерийного токсина видимых изменений не будет
При отсутствии антитоксического имммунитета наблюдается воспалительная реакция

Реакция нейтрализации токсина in vivo

определенныхсоотношениях с анти­токсической сывороткой образовывать помутнение- инициальную флоккуляцию
Механизм реакции флоккуляции аналогичен таковому реакции преципитации.
Применяется для титрования антитоксических сывороток и определения типа токсина
Специфическую активность или силу анатоксина определяют в реакции флоккуляции в так называемых единицах флоккуляции— (Lf) .
Силу антитоксической сыворотки выражают в международных антитоксических единицах – МЕ
Одна антигенная единица анатоксина обозначается Limes flocculationis (Lf — порог флоккуляции), это то количество анатоксина, которое вступает в реакцию флоккуляции с одной единицей антитоксина.
То есть, условие инициальной флоккуляции: nLF=n МЕ

Реакция нейтрализации токсина in vitro
Реакция флоккуляции

В данном опыте помутнение – инициальная флоккуляция – происходит в пробирке №3
Каждая пробирка содержит 2х20=40Lf токсина
Поскольку условие инициальной флоккуляции: nLF=n МЕ, то в данной пробирке 40 МЕ сыворотки
Если 0,4 мл сыворотки содержат 40МЕ, то 1мл- 100МЕ

и нетоксигенными.
Образование экзотоксина зависит от наличия в бактериях профага, несущего tox-ген, кодирующий образование экзотоксина.
При заболевании все изоляты тестируются на токсигенность — продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью реакции преципитации в агаре
Главное преимущество – отсутствие необходимости выделения чистой культуры

Реакция нейтрализации токсина in vitro
Реакция преципитации в геле

целью обнаружения ботулотоксина.

Возбудитель ботулизма - Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е.

Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками.

Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е.

Контролем служит нормальная сыворотка.

Учет.
В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (зонтик), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.

Вывод: В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.

эритроциты, на которых адсорбированы антитела. Антиген –дифтерийный токсин

«+» «-»

антиген.

Компоненты реакции:
Эритроцитарный диагностикум с дифтерийным анатоксином
Стандартная противодифтерийная сыворотка (антитела против дифтерийного токсина)

Исследуемая сыворотка ?
Принцип метода




Результаты:



При отсутствии антигена в исследуемой сыворотке
диагностикум взаимодействует со стандартной сывороткой и наблюдаем гемагглютинацию
При наличии антигена в исследуемой сыворотке антитела в нашей диагностической сыворотке будут нейтрализованы и агглютинации эритроцитов не будет

+

?

(

)

+

«-» «+»

взаимодействии специфических антител с антигенами клеток (эритроцитов, бактерий), на их поверхности образуется комплекс антиген-антитело, который активирует комплемент по классическому пути, вследствие чего наступает лизис этих клеток.

присутствии специфических антител-бактериолизинов и комплемента лизис бактерий идет существенно интенсивнее

Под воздействием бактериолизинов в присутствии комплемента микробы теряют подвижность, меняют форму (набухают), распадаются и, наконец, совсем растворяются.
Реакция бактериолиза применяется с целью идентификации холерных вибрионов (р. иммобилизации вибрионов холерными сыворотками) и определения вибриолизинов в сыворотке; при сифилисе (р. иммобилизации трепонем), при лептоспирозе (р. агглютинации-лизиса).

присутствии аг (эритроциты барана), соответствующих антител и комплемента
В отсутствии одного из ингредиентов гемолиза не наблюдается

комплемент и две системы антиген - антитело. 
Первая система – специфическая :антиген, антитело (испытуемая сыворотка) и комплемент (сыворотка морских свинок)
Вторая система – неспецифическая индикаторная – гемолитическая (эритроциты барана с гемолитической сывороткой, лишенной собственной активности комплемента).

инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент, 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним.

При соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), таким образом происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная)

Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная).

-

+

0,15 мл.

В опыте активность комплемента может снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для опыта количество комплемента увеличивают: берут следующую за титром дозу. Это - рабочая доза.

В приведенном примере она равна 0,2 мл комплемента в разведении 1:10.

Для приготовления гемолитической системы смешивают равные объемы гемолитической сыворотки и взвеси эритроцитов.

Так как все компоненты, участвующие в РСК, должны быть взяты в равных объемах (в нашем примере он равен 0:5 мл), необходимо к рабочей дозе комплемента (0,2 мл 1:10) добавить 0,3 мл изотонического раствора

К2 К3 К4

Специфическая система:
Антитела (сыворотка в различных разведениях). 
Антиген - диагностикум
Комплемент по 0,5 мл
Смешивают, инкубируют 60 минут при 37°С. 

Индикаторная система Добавляют по 2 мл гемолитической системы (ГС)
Смешивают, инкубируют 30 минут при 37°С. 
Учитывают результаты реакции.

К1 – контроль сыворотки (сыворотка + комплемент+ГС
К2 – контроль антигена (антиген+комплемент+ГС)
К3- контроль гемолитической системы (2мл ГС+физраствор)
К4 – контроль комплемента (2 мл ГС+ 0,5мл комплемента)

В нашем примере результат положительный.
Титр сыворотки 1:80

5 дней после первого исследования титр выше, что свидетельствует о развитии иммунного ответа на данный антиген

Микрореакция ставится по тому же принципу, что и РСК, но с меньшими объемами в микроплатах

из агара, содержащего эритроциты барана и комплемент.
После внесения в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них, в результате радиальной диффузии антител, образуется зона гемолиза.
Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, краснухой, клещевым энцефалитом.
Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после чего к этому комплексу присоединяются компоненты комплемента, вызывая гемолиз

метод выявления специфических Аг с помощью Ат, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.
Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфек­ционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике.

Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на спо­собности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками,  не    нарушая    их    иммунологической   специфичности.

том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.

Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета. 

АГС (антиглобулиновая
сыворотка)

Пневмококки

антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом.

Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают специфическими антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки.

Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами.

В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом.

Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.. 

Treponema pallidum

или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело.
Метод основан на использовании антител с использованием фермента в качестве метки.

С помощью ИФА определяют наличие антигенов возбудителей различных инфекций, но значительно чаще метод ИФА применяется для определения наличия антител классов IgA, IgM, IgG  к антигенам различных возбудителей болезней.

раствора в лунке является положительным результатом.

Фотография микропланшета

При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом.
После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат)
Связанный с антителом фермент обнаруживают по изменению цвета раствора после добавления субстрата (перекись водорода) и хромогена

антител.

В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген и инкубируют с образцами сыворотки или другого биологического материала, полученного от больного (спинномозговая жидкость, слюна и др.).

Специфические антитела, связавшиеся с антигеном на твердой фазе, выявляют с помощью антиглобулинового конъюгата(антиглобулиновая сыворотка с ферментной меткой).

В зависимости от цели анализа используют разные антиглобулиновые реагенты, выявляющие антитела всех изотипов, либо специфичные к отдельным классам и подклассам иммуноглобулинов.
Основное достоинство метода состоит в универсальности конъюгата. Один и тот же коньюгат может служить для выявления антител человека к самым разным антигенам в любых образцах.

немеченых (исследуемых) антител за связывание с антигеном, адсорбированным на твердой фазе.

Количество фермента, присоединившегося к твердой фазе, уменьшится пропорционально содержанию в смеси свободных антител.

Для определения антигена используется тот же вариант, но в этом случае искомый антиген конкурирует с меченым, стандартным антигеном за связывание с антителами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы

 Искомый антиген(1)
и меченый ферментом антиген(2)
конкурируют друг с другом за антитела (3), сорбированные на твердой фазе.

изотопом, подавляется в присутствии немеченного антигена. Методика РИАпроста и включает следующие основные этапы:

А. К раствору антител добавляют меченный антиген и пробу (содержащую неизвестное количество немеченного антигена). Концентрацию антител в реакционной смеси подбирают так, чтобы число мест связывания было намного меньше общего числа антигенов. Концентрация меченного антигена должна превышать максимальную возможную концентрацию антигена в пробе.

Б. Реакционную смесь инкубируют при определенной температуре. Меченный и немеченный антигены конкурентно связываются с антителами, при этом образуются иммунные комплексы, содержащие либо меченный, либо немеченный антиген. Таким образом, к концу инкубации в реакционной смеси присутствуют меченные и немеченные иммунные комплексы, а также свободные меченные и немеченные антигены. Количество меченных иммунных комплексов обратно пропорционально количеству немеченного антигена в пробе.

В. Чтобы оценить количество меченных иммунных комплексов, их отделяют от свободного меченного антигена. Иммунные комплексы, имеющие большую молекулярную массу, чем свободные антигены, осаждают центрифугированием и измеряют радиоактивность осадка.

Г. Определяют концентрацию антигена в пробе по калибровочной кривой.

Рис. 8. Радиоиммунологический анализ:1 - антиген; 2 - антитело; 3 - радиоактивная метка.

Радиоиммунологический анализ:
1 - антиген;
2 – стандартныйантиген с радиоактивной меткой;
3 - антитело.

РИА - один из самых чувствительных методов иммунодиагностики. Его применяют для выявления антигена вируса гепатита В , у больных вирусным гепатитом. 

1

2

3

- от англ, blot, пятно) из геля на активированную бумагу (1) или нитроцеллюлозную мембрану
и проявляют с помощью ИФА.

Фирмы выпускают такие полоски с "блотами" антигенов. На эти полоски (стрипы) наносят сыворотку больного (2). Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом (3).
Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата (4), изменяющего окраску под действием фермента.

Пример: Лайн-блот для диагностики TORCH-инфекций (Токсоплазмоз, Краснуха, Цитомегаловирус, ВПГ 1 и ВПГ 2)

больного в очень сходных симптомах, и в тоже время клиническая картина инфекции, вызванная определенным вирусом, может быть весьма разнообразной по своей симптоматике. Определить возбудителя, особенно при тяжелых заболеваниях, важно и для прогноза дальнейшего течения болезни, установления ее отличий от неинфекционных заболеваний со сходными симптомами и выбора правильного способа лечения. Быстрая лабораторная диагностика позволяет провести неотложные и правильные противоэпидемические мероприятия и обнаружить источник вирусной инфекции.
Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:
выделение и идентификацию возбудителя;
обнаружение и определение титров противовирусных антител;
обнаружение антигенов вирусов в образцах исследуемого материала;
 микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.
Забор материала. При заборе материала для исследований необходимо выполнять следующие условия:
образцы следует отбирать как можно раньше либо с учетом ритма циркуляции возбудителя;
материал следует отбирать в объеме, достаточном для всего комплекса исследований;
образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковременной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длительной - при температуре -50°С.

их культивируют в культурах клеток,куриных эмбрионах или организмах чувствительных животных.
Для диагностики вирусных заболеваний применяют следующие методы:
Вирусоcкопический.
Иммунной  электронной  микроскопии.
Вирусологический.
Серологический.
Иммунофлюоресцентный.
Биологический.
Использование ДНК-(РНК)-зондов.
Цепная  полимеразная  реакция.

вирусов и с помощью серологических методов.

определения фаготипа по лизису штаммов бактерий одного и того же вида типоспецифическими фагами, что важно для маркировки исследуемых при эпидемиологическом анализе заболеваний с целью установления их видовой принадлежности;   
 фагодиагностики, заключающейся в выделении фага из организма больного (например, из испражнений), что косвенно свидетельствует о наличии в материале соответствующих микроорганизмов; 
 фагопрофилактики - предупреждения некоторых заболеваний (например, дизентерии) среди лиц, находящихся в эпидемическом очаге;   
фаготерапии - лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызванных, например, шигеллами, протеем, стафилококком.
Бактериофаги с целью терапии применяют местно путем аппликации на раневую или ожоговую поверхность, введением в полости (брюшную, плевральную, суставную, мочевой пузырь), через рот, а также ректально. Соответственно способу применения препараты бактериофагов выпускают в различных лекарственных формах –
жидком виде,
таблетках с пектином или кислотоустойчивым покрытием,
мазях,
свечах,
аэрозолях.